诊断与检测方法详谈

发表日期:2005/6/10 22:10:27 | 来源 :http;//www.aids-china.com
抗体检测
二.HIV抗体初筛实验
三.HIV抗体确认实验


一.血清HIV-1抗体检测

感染HIV-1后,机体针对HIV-1基因编码的抗原性物质产生相应抗体,在临床上具有重要诊断学意义的主要是对抗结构基因编码抗原(如gpl60,gpl20,gp41,p66,p55,p51,p31,p24,p17等)的抗体。

由于个体差异、各种病毒蛋白的浓度和抗原性强弱不同及不同个体对不同抗原成分的反应性均有所不同,因此相应抗体的产生时间和不同个体对相同抗原成分的免疫应答强度等存在一定差别,此外,检测方法和使用试剂的敏感性不同对HIV-l抗体的检出时间产生一定影响。在感染HIV-1后,患者血清中最先出现p24抗原,继之,各种HIV-1抗原可达到高峰;2-6周后,随着HIV-l抗体产生及浓度的不断增加,HIV-l抗原渐趋降低或检测不出。临床通用的是酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹法(WesternBlot)和目前开始推广的快速诊断法。

用于初筛实验的HIV抗体检测试剂必须是HIV-1/2混合型,经卫生部批准或注册,并在有效期内,通过批检检定合格,进口试剂还必须要求提供进口许可证和中国生物制品检定所检定合格证书。

市售试剂大致可分为以下几类:

第一代试剂:使用HIV全病毒裂解物为抗原,应用间接法原理检测HIV抗体。如日本富士公司生产的HIV-PA试剂。

第二代试剂:使用在细菌或真菌中表达的人工重组或化学合成多肽HIV抗原,应用间接法原理检测HIV抗体。基因重组通常易于在培养基中生产大量同源性抗原,产品为单一目的基因而非多样性抗原混合,特异性高于第一代试剂。

第三代试剂:使用合成多肽HIV抗原(少数用重组抗原),应用双抗原(或双抗体)夹心法原理检测HIV抗体(或抗原)。由于标记HIV抗原可同时检测血清中HIV-1 IgG、IgM、 IgA抗体,此类试剂的敏感性和特异性均优于标记抗人免疫球蛋白的间接法。

第四代试剂:此类试剂在第三代试剂盒基础上,将针对P24抗原的抗体与HIV-1抗原一起包被固相载体,可同时检测HIV-1 IgG、IgM、 IgA抗体和P24抗。

二.HIV抗体初筛实验

HIV-1抗体检测包括HIV-1抗体初筛和HIV-抗体确认两部分。初筛检测通常由取得资格的HIV-1抗体初筛实验室和/或确认实验室中进行,HIV-1抗体确认和HIV-1抗体阳性报告必须由取得资格的确认实验室进行。

方法和原理:酶联免疫吸附试验(Ezyme linked immunosorbentassay,ELISA)简称酶标法,是根据酶免疫测定原理发展的一种技术,其基本方法分三类:间接法、双抗原夹心法和抗体竞争法。

各厂生产的不同原理ELISA法HIV检测试剂盒的试验方法和操作步骤基本相同,只是在作用时间、标记酶的种类、反应底物、样本加量等方面有所差异。
初筛检测的几个问题

初筛检测的阳性结果不是最终结论,不能通知受检者本人及其他人员,样本需经该试剂和另一种试剂复检,如仍为阳性,应及时送实验室进行确认;初筛检测的宗旨是避免漏检,因此应选用敏感性高的符合国家要求的高质量试剂,且必须为HIV-1/2混合型;各单位可根据不同目的、检测对象、人群流行率、成本-效益、实验室设备和技术水平等选择不同初筛实验方法;交叉反应性或假阳性反应:某些病毒如CMV、EBV等,寄生虫如疟原虫的部分抗原性物质和某些自身免疫病患者,如系统性红斑狼疮和风湿病者体内的自身抗体与HIV-1的某些抗原决定簇有交叉反应性,在初筛检测时可能导致假阳性现象。此种情况下,样本OD值与临界值的比值通常为1—1.2,对这种结果除应排除HIV-1的早期感染,或感染HIV-2,HIV-1“O”亚型的可能外,还应注意假阳性,以及实验操作过程中的技术误差;不同厂家及同一厂家生产的不同批次试剂的敏感性和特异性可能存在一定差异,各实验室最好应用标准质控血清对新购试剂及在每次检测时进行质量控制和质量评价,以确保检测工作结果的准确可靠性。


三.HIV抗体确认实验

根据卫生部规定,HIV-1抗体阳性报告必须由卫生部认证并取得资格的HIV抗体确认实验室出具才有法律效应。

最常用的HIV-1抗体确认实验方法是免疫印迹法(Wwstern Blot,WB)和条带免疫印迹法(Strip Immunoblot Assay, SIA或Linear Immunoblot Assay, LIA),其中以WB法最常用。

免疫印迹实验:用于检测单克隆或多克隆抗体识别的抗原,也是目前国内HIV抗体确认的首选方法,他能同时检测不同HIV-1抗原组分的抗体,因此能够鉴别或肯定初筛检测的结果。
 

条带免疫印迹法:工作原理和操作方法与WB实验基本相同,只是条膜上抗原来源和组成有所区别。检测时信噪比高,本地清晰,无潜在假阳性干扰,且可通过调整条膜上HIV抗原量,克服了WB实验中使用病毒裂解产物而可能产生的固相载体上某些重要抗原量不足的缺点。这类试剂特异性很高,但也可能由于病毒株在所合成抗原决定簇部位发生突变导致HIV抗体假阴性结果;另一个缺点是由于合成抗原不能糖基化,其立体构像与天然抗原分子有一定差异,在一定程度上可能影响了模拟真实HIV抗原检测抗体的能力。

HIV-1抗体确认实验结果的评价 免疫印迹实验的结果是根据硝酸纤维素条膜特异性HIV抗原位置上出现的带型不同来判断HIV抗体为阳性、阴性和不确定。 阳性和阴性结果的判断标准:美国CDC的标准为国际公认。

阳性和阴性结果的判断标准
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